一、服務(wù)介紹

Masson染色用于膠原纖維和肌纖維的染色及鑒定；染色結(jié)果：膠原纖維呈藍色、肌纖維呈紅色、細胞核呈藍黑色。

二、實驗原理

1.膠原纖維是人體中的結(jié)締組織的主要成分，分布在全身的各個部位，組成膠原纖維的主要成分是膠原蛋白。新鮮時呈白色，故一般稱為白色纖維。在HE染色中被染為淡紅色。它的性質(zhì)是具有韌性及緊固性，因此它能夠抵抗的牽拉力而不至于撕裂或拉斷它們常聚集成粗細不等的束，呈波浪狀。膠原纖維由許多根纖細的膠原纖維組成。在電鏡下膠原原纖維又由更細的原纖維構(gòu)成。根據(jù)Kramen和Little所進行的電鏡研究證實，膠原纖維是特有的，具有橫紋的（重復(fù)期為650）原纖維。當有病變時這些纖維可發(fā)生變形，常出現(xiàn)的就是膠原纖維的壞死，膠原纖維在稀酸里可發(fā)生膨脹，變成膠樣物。它們能被酸性染料染成深淺不一的粉紅色，這些往往跟淀粉樣物難以區(qū)別。由于它們的屈光率較弱，因而在光學(xué)顯微鏡下，很難與纖維區(qū)別。膠原纖維的分子長度約為3000，直徑約為14，分子量為300000。

2.膠原纖維的組成：

1) 細胞內(nèi)合成前膠原蛋白分子，成纖維細胞攝取合成蛋白質(zhì)所需的氨基酸，包括脯氨酸、賴氨酸和甘氨酸。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上按照特定的膠厚mRNA的堿基序列，合成前α-多肽鏈。后者邊合成邊進入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，并在羥化酶的作用下，將肽鏈中的脯氨酸和賴氨酸羥化經(jīng)羥化后，三條前α-多肽鏈互相纏繞成繩索狀的前膠原蛋白分子。溶解狀態(tài)的前膠原蛋白分子，兩端未纏繞，呈球狀構(gòu)形，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔風(fēng)或轉(zhuǎn)移到高爾基復(fù)合體內(nèi)加入糖基后，分泌到細胞外。

2) 厚膠原蛋白分子的細胞外聚合。細胞外的前膠原蛋白分子，在肽內(nèi)切酶的作用下，切去分子兩端球狀構(gòu)表部分，形成厚膠原蛋白分子，粗約1.5nm，長約300nm，厚膠原蛋白分子平行排列聚合成膠原纖維。聚合時，相互平的相鄰分子錯開1/4分子長度，同一排的分子，菌尾相對并保持距離，聚合成束，于是形成具有64nm周期橫紋的膠原原纖維。聚合時，分子內(nèi)，分子間的化學(xué)基因進行縮合，交聯(lián)，增加厚纖維的穩(wěn)固性。若干膠原原纖維經(jīng)糖蛋白粘合成粗細子等的膠原纖維。中性自溶型膠原（neutrla-soluble collagen）→醛糖、縮醛類脂/肉豆蔻酸、類脂→不溶型膠原（insoluble collagen）

3.膠原纖維的顯示：

膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色，除此之外，它還可以用一些陰離子的染料來進行染色，如用淡綠可把它們?nèi)緸榫G色，用甲苯胺藍可將其染為藍色，在網(wǎng)狀纖維染色中，如不加以處理，它又可被染為棕黃色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫細胞化學(xué)染色中，膠原纖維由于含的負電荷過多，常導(dǎo)致某些非特異性的染色，應(yīng)特別注意。

三、實驗步驟

1.Van Gieson（V.G）染色法

1）試劑的配制：

weigert氏蘇木素

A液： 蘇木素 1g （haematoxylin）+ 無水酒精 100ml

B液： 30%三氯化鐵 4ml （ferric chloride）+蒸餾水 95ml+鹽酸 1ml

Van Gieson氏液

A液： 酸性品紅 1g（acid fuchsin）+蒸餾水 100ml

B液： 苦味酸飽和水溶液，（1.22%）（picric acid）

注意事項：

Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合，幾個小時內(nèi)用完，不得超過一天。

蘇木素配后經(jīng)二十多天才能成熟，提前配制。

該液能抵抗弱酸性染液，對已著染的細胞核在酸性染液的作用，不易被脫去顏色，如果不特別深染，則無須分化。

Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。

2）操作方法：（后面的各種方法，如沒特別說明，都在室溫下進行）

切片脫蠟至水

用Weigert氏蘇木素染20min

水洗，時可分化

流水沖洗10min

染Van Gieson氏液1min

用95%酒精快速分化

無水酒精脫水，二甲苯透明，封固。

結(jié)果：

膠原纖維：鮮紅色，肌纖維： 黃*色，紅細胞： 黃*色，細胞核： 藍黑或灰色。

注意事項：

該法染完的切片，較易褪色如需照相，應(yīng)盡早完成。

蘇木素染液如為棕色或沉淀，應(yīng)將其拋棄。

分化用的酒精，應(yīng)使用95%以上的酒精，低濃度的酒精褪色能力強，容易將著染的紅色脫去。

切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素，染核效果基本一樣。

2.Masson氏三色染色法：

1）相關(guān)試劑的配制：

天青石藍液的配制：

天青石藍（Celestin blue B） 1.25g

硫酸鐵銨（ferric ammonium sulfate）1.25g

蒸餾水 200ml

甘油（glycerin） 30ml

將前兩者溶于蒸餾水中，然后煮沸，冷卻后過濾，再加入甘油和麝香草酚。

Mayer氏蘇木素的配制：

蘇木素 0.1g

蒸餾水 100ml

鉀明礬（Potassium alum） 5g

檸檬酸（Citric acid） 0.1g

水合氯醛（Chloral hydrate）20mg

配制法：

將蘇木素放入蒸餾水中，用玻棒不停地攪拌直至溶解，再依次加入鉀明礬，檸檬酸和水合氯醛，再繼續(xù)攪拌，后加入碘酸鈉，攪拌均勻，即可使用。

麗春紅酸性品紅液的配制：

麗春紅（ponceau 2R） 0.7g

酸性品紅（acid fuchsin）0.3g

冰醋酸 1ml

蒸餾水 99ml

2）操作方法：

A　切片脫蠟至水，

B　1%高錳酸鉀氧化切片5min，

C　水洗，草酸漂白1min，

D　水洗，蒸餾水洗，天青石藍染5min水洗，

E　摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏蘇木素3-5min，

F　流水沖洗5-10min，

G　麗春紅苦味酸飽和液染5min，

H　1%醋酸水溶液洗，

I　1%磷鉬酸分化切片約5min，

J　蒸餾水洗，

K　1%淡綠或者甲苯胺藍滴染30s，

L　1%醋酸水溶液洗切片，

M　95%酒精分化，無水酒精脫水，

N　二甲苯透明，中性樹膠封固。

3）結(jié)果：

膠原纖維呈現(xiàn)綠色或藍色，細胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍色，肌肉和胞質(zhì)紅細胞呈現(xiàn)紅色。

4）注意事項：

①　Masson氏染液配完后保存時間不宜過長，如有可能，每次染色以染配為佳，如何可使著色顏色的鮮艷性。

②　切片在各級酒精中脫水，時間不宜過長，否則會將著染的顏色脫去。

③　切片保存所著染的顏色顯長為1-2年以后會隨著時間的延長而逐漸褪去，應(yīng)予注意。

④　磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同，磷鉬酸作用于膠原纖維，磷鎢酸作用于纖維膠]質(zhì)，肌膠質(zhì)，神經(jīng)膠質(zhì)和上皮纖維等。上述兩種試劑的使用，可以促進組織有選擇的染色，它們可以減少背景和核的染色，使背景清晰。

⑤　如有可能，在組織固定時，用Zenker氏固定液固定，如此對染色效果將更好。